Методы Генодиагностики в Микробиологии

ПЦР - это метод, который позволяет проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации и используется для получения копий непротяженных участков ДНК, специфичных для каждого конкретного наследственного или инфекционного заболевания, а также исследуемого генетически обусловленного признака, и, кроме того, для визуализации (в случае присутствия) таких специфических участков, что и является целью генодиагностики.
В основе метода ПЦР лежит способность хорошо известных в молекулярной биологии ферментов, ДНК-полимераз, осуществлять направленный синтез второй, т.е. комплементарной цепи ДНК, по имеющейся матрице одноцепочечной ДНК, наращивая небольшую олигонуклеотидную затравку (праймер), комплементарную участку этой матрицы, до размеров в несколько тысяч или даже десятков тысяч звеньев. Повышая температуру, можно добиться остановки реакции и последующей денатурации полученной ДНК, т.е. разделения цепей полученной в ходе реакции двуцепочечной ДНК. Если в реакционной смеси присутствует избыток праймера, то, значительно снизив температуру, чтобы праймер мог вновь связаться с тем же самым комплементарным участком ДНК, и добавив новую порцию фермента, можно вновь установить температуру, необходимую для реакции полимеризации, и, таким образом, проведя реакцию еще раз, увеличить количество ранее полученного продукта. Многократное, или как говорят циклическое, повторение этой процедуры позволяет наработать значительное количество копий участка ДНК, начинающегося с данного праймера. Принципы метода были впервые предложены профессором Корана в 1971 году.

Собственно как метод ПЦР возникла, когда в описанном выше процессе стали использовать не просто ДНК-полимеразу, а так называемую термостабильную ДНК-полимеразу, т. е. фермент, способный без ущерба для своей активности переносить временный высокотемпературный нагрев реакционной смеси, необходимый для денатурации ДНК. Это позволило проводить реакцию копирования ДНК без добавления свежей порции фермента после каждого цикла и использовать для работы специальные приборы-термостаты с меняющимися температурно-временными режимами - так называемые термоциклеры или амплификаторы ДНК. Широкомасштабное применение метода ПЦР в практической деятельности началось, когда производство обеспечило доступность термостабильных ферментов для потребителей.
Каждый цикл ПЦР состоит из трех этапов, суть которых описана ниже.
На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95°С, в результате чего двуцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. На втором этапе происходит отжиг (присоединение праймеров к ДНК-мишени с образованием коротких двухцепочечных участков ДНК, необходимых для инициации синтеза ДНК). Для обеспечения этого процесса праймеры берутся в избытке по отношению к матрице. С образовавшимися комплексами праймер-матрица связывается ДНК-полимераза и на третьем этапе происходит одновременное копирование ДНК с двух праймеров комплементарных участкам ДНК на противоположных цепях и расположенных таким образом, что полимеризация ДНК с одного праймера приводила к синтезу цепи ДНК, в которой на определенном удалении содержался участок ДНК, комплементарный другому праймеру (рис. 1.) .
Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. Принципиально, что синтезированные в ходе первого цикла